本发明公开了一种抗菌多肽修饰聚氨酯纳米薄膜的制备方法，包括步骤：1)制备抗菌多肽修饰的聚氨酯树脂；2)将步骤1)得到聚氨酯树脂溶于合适溶剂中，通过旋涂法获得纳米薄膜，而后UV光固化后干燥除去溶剂，最终得到所需的抗菌多肽修饰聚氨酯纳米薄膜；其中，所述溶剂为四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙醇、水中的一种或几种组成。通过本发明方法制得的抗菌多肽修饰聚氨酯纳米薄膜的生物安全性好，使用方便舒适，能物理粘附于不同形貌的组织，抗菌效果好且不会产生细菌抗性。