本发明公开了一种京尼平交联抗菌肽/季铵化纤维素复合水凝胶抑菌剂及其制备方法与应用。本发明方法包括将纤维素粉分散到尿素碱体系中，预冻处理，快速搅拌得到纤维素溶液；加入环氧氯丙烷，搅拌混匀，反应，产物洗涤至中性，得到纤维素水凝胶；加入过硫酸钾和水，反应；再加入二甲基二烯丙基氯化铵，进行接枝反应，得到季铵化纤维素水凝胶；加入到乳酸链球菌素水溶液中，调节pH为5.0，加入京尼平进行交联反应，产物洗涤、干燥。该方法制备水凝胶抑菌剂操作简单、制备迅速、可塑性较高。所得抑菌剂安全无毒、可降解、生物相容性高，同时具有高效抑菌性和广谱性、持久性和易回收利用等特点，不会产生细菌耐药性，具有良好的应用前景。