本发明提供一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用，氨基酸序列为Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ。本发明应用现代酶催化技术对酪蛋白进行酶解，利用生物分子分离纯化技术对具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的活性单肽进行氨基酸序列分析。该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用，可以安全的添加的到酸乳中，将该生物活性肽作为酸乳发酵添加剂提高酸乳产品质量。