本发明公开一种二型登革热病毒NS1蛋白多价纳米抗体及制备方法，属于基因工程和生物制药技术领域。该多价纳米抗体是由VHH抗体片段通过连接肽连接构成；所述VHH抗体片段的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。通过构建表达载体pET?22b?VHH?linker?VHH、pET?22b?VHH?linker?VHH?linker?VHH，分别成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶表达。与单价抗体相比，重复串联后得到的二价及多价VHH抗体的亲和力有显著提高。本发明实现了二型登革热病毒NS1蛋白多价纳米抗体的高效可溶表达，易于放大生产，成本低廉；具有更高稳定性和亲和力；更有大规模生产及应用的潜能。