本发明公开了一种高浓度下多粒子三维追踪方法，包括以下步骤，使用数字全息显微镜获取样品全息图像，计算背景图并在样品全息图像中扣除背景图；然后进行重构，得到重构后的样品全息图像；通过光强阈值和寻找局部光强最大，得到粒子三维位置；使用最邻近算法将粒子位置连接成轨迹；选取第一轨迹L1和第二轨迹L2；对第一轨迹L1和第二轨迹L2进行轨迹归属判断；若判断为同一条轨迹，则补全第一轨迹和第二轨迹之间缺失的粒子位置；设置纠错距离，对第一轨迹L1和第二轨迹L2的归属是否正确进行判断；本发明对轨迹进行归属判定、补全和校正，有效地提升了正确率，增加了轨迹信息量，提升了高密度下三维粒子追踪技术的适用性。