本发明公开了一种微粒实时三维动态行为的监测方法，采用同轴数字全息显微镜记录实时全息图，通过数值重建微粒的散射光场，利用局部光强最大，得到微粒三维位置；将微粒的各三维位置连接成轨迹；计算不同时间间隔下轨迹的均方根末端距，得到MSD?Δt曲线；拟合曲线，将轨迹进行分类；计算分类后各微粒瞬时速度、瞬时速度矢量与z朝上方向夹角及各轨迹平均速度；确定界面所在位置，计算各轨迹点到界面的轴向距离，微粒密度和速度的空间分布及θ的分布；本发明同时对多个微粒进行测量，轴向定位精度达亚微米级别；能够获取微粒实时三维坐标；无需荧光标记，无损成像；成像深度达上百微米，非常适合对各类微粒的活动进行动态三维追踪和分析。