本发明公开了一种基于多光谱成像在线测定鱼肉新鲜度指标Ｋ值的方法，首先利用传统的高效液相色谱法测定冷藏不同天数的鱼肉样本的新鲜度指标Ｋ值，然后利用可见近红外多光谱成像系统扫描相应的鱼肉样本，得到相应的多光谱图像，并对多光谱图像进行预处理，提取中心波长为４２５ｎｍ、５６０ｎｍ、６６０ｎｍ、７９５ｎｍ和９６０ｎｍ处的平均反射光谱值，基于所获取的Ｋ值和平均光谱值，利用最小二乘支持向量机建立预测模型，并对待测鱼肉样品进行预测。本发明采用多光谱成像技术评价鱼肉新鲜度，提高了预测精度，降低了传统方法所需时间，可以有效实现快速、无损、非接触在线检测的目的。